ACARA VII
MUTASI DAN TRANSPOSON MUTAGENESIS

I. TUJUAN
Untuk mengetahui perubahan material genetik akibat adannya mutasi baik secara alami (spontaneous mutation) maupun secara buatan dengan menggunakan transposon mutagenesis.

II. METODOLOGI
Praktikum Genetika dan Taksonomi Mikrobia Acara VII mengenai Mutagenesis dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi II, Program Studi Mikrobiologi Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarata. Praktikum ini meliputi du asub acara yakni Spontaneous Mutagenesis dan Transposon Mutagenesis. Bahan yang dibutuhkan dalam praktikum kali ini antara lain kultur Rhizobium spp., kultur E. coli dengan gen GFP, medium YM, medium LB, antibiotik rifamicin, antibiotik amphicilin, ethanol, larutan,10mM Mg SO4, kertas nitroselulose, Sedangkan bahan yang digunakan antara lain adalah tabung reaksi, petridish, drigalski, microtube eppendorf, mikropipet, vorteks, sentrifuge, dan inkubator.
Cara kerja dari praktikum kali ini dapat dilihat dalam bagan di bawah ini.
1. Spontaneous Mutagenesis
Rhizobium spp.


YM cair inkubasi over night 37° C


Ambil 1 ml cultur


Inokulasi ke YM padat + rifamicin 70 mg/ml


Koloni yang tumbuh merupakan hasil Spontaneous Mutagenesis
(bakteri Rhizobium spp. dengan gen Rif+)

2. Transposone Mutagenesis

Rhizobium spp E. coli
Rif+ + med LB (GFP, Amp+)
Umur 1-2 hari Umur 1-2 hari
0,75 ml 0,75ml




Eppendorf 1,5 ml


vorteks


sentrifuge 5000 rpm 10’


supernatant buang, + 1 ml MgSO4, vorteks


sentrifuge 5000 rpm 10’


supernatant buang, + 50 ml MgSO4, vorteks


Ditanam pada kertas nitroselulose pada medium LB padat
inkubasi 37° over night


Koloni yang muncul dipindah ke medium


Dituang sebanyak 1ml ke dalam medium LB
yang mengandung 50 mg amphicilin dan 20 mg rifamisin


koloni yang terbentuk adalah bakteri Rhizobium spp. dengan
gen GFP + amp+ + rif+ yang bila dilihat pada sinar UV
akan berpendar
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Mutasi dapat diartikan sebagai perubahan material genetik (baik DNA maupun RNA). Mutasi dapat berupa (a) perubahan nukleotida yang dapat merubah kode genteik dan komposisi asam amino dari suatu protein tertentu atau mutasi berupa penghentian proses translasi yaiu dengan berubahnya stop kodon, (b) merubah reading frame, (c) penghilangan, (d) maupun penyisipan.
Transposon adalah unsur DNA yang dapat berpindah dengan sendirinya diseputar genom dan telah diketahui dan ditemukan hampir pada setiap organisme. Unsur atau bagian DNA ini dapat ditransfer ke dalam kromosom pada berbagai lokasi, tetapi bila ia (transposon) berpindah ke tengah gen maka yang akan terjadi adalah kerusakan gen. tetapi kelebihannya metode transposon relative lebih bersih, karena tidak menyebabkan perubahan besar pada struktur genome. Kegunaan transposon yaitu :(1) dapat memobilisasi gen, (2) dapat memutagenesis gen, (3) dapat merekombinasi gen, (4) juga sangat berpengaruh terhadap regulasi gen.
Pada praktikum ini dilakukan mutasi spontan dengan menumbuhkan bakteri Rhizobium spp yang tidak memiliki gen ketahanan terhadap rifamisin ke dalam medium yang mengandung rifamisin. Untuk memperoleh mutan Rif+ maka jumlah bakteri yang diambil dari kultur harus lebih besar dari 106 sel bakteri karena mutasi spontan dapat terjadi dalam 1:106 sel. Oleh karena itu, dalam percobaan mutasi spontan digunakan kultur bakteri dalam volume yang sangat banyak untuk ditumbuhkan dalam medium yang mengandung rifamisin karena diasumsikan pada 1ml kultur mengandung lebih dari 106 sel bakteri.
Gambar 1. Rhizobium spp yang mengandung gen GFP+, amp+, + rif+
Gambar 2. Rhizobium Spp. yang berpendar pada sinar UV



Dari percobaan yang dilakukan berhasil diperoleh mutan spontan, dimana bakteri Rhizobium spp mampu tumbuh pada medium agar yang diberi antibiotik rifamicin. Sehingga dapat dipastikan didalam bahan genetik bakteri tersebut terdapat gen rif+. Mutan ini nantinya akan digunakan dalam percobaan selanjutnya yaitu percobaan melakukan mutasi dengan bantuan transposon.
Dalam praktikum mutasi dengan transposon ini digunakan kultur bakteri Rhizobium spp sebagai resipien yang merupakan hasil dari percobaan mutasi spontan, yang resisten terhadap rifamisin. Sedangkan sebagai donor digunakan E. coli yang membawa transposon dengan ketahanan terhadap antibiotik ampisilin serta memiliki gen GFP yang mampu berpendar dengan warna hijau saat dikenai sinar UV. Dipilih E. coli karena E. Coli mempunyai gen a yang dapat melakukan perkawinan (matting) dengan mikroorganisme lain.
Tingkat keberhasilan mutasi dengan transposon ini terdeteksi dengan tumbuhnya koloni bakteri pada medium agar LB yang mengandung ampisilin dan rifamisin. Selain itu, tingkat keberhasilan terjadinya mutasi dengan transposon dapat diketahui dengan memberikan paparan sinar UV pada koloni yang tumbuh. Apabila koloni berpendar kehijauan saat terpapar UV maka diasumsikan telah terjadi mutasi karena transposon. Dari percobaan yang dilakukan berhasil diperoleh satu koloni kecil yang dapat berpendar kehijauan dibawah paparan sinar UV.
Hasil praktikum berupa pertumbuhan koloni pada medium yang mengandung antibiotik rifamisin dan ampisilin, jadi dapat disimpulkan bahwa telah terjadi perpindahan material genetik E. Coli ke koloni bakteri Rhizobium spp. Hasil tersebut dikuatkan dengan melalui pengamatan dibawah sinar UV pada koloni yang tumbuh. Warna kehijauan yang berpendar dari koloni bakteri menunjukan bahwa terjadi mutasi karena transposon yang dibawa. Dari hasil pengamatan percobaan, terdapat koloni bakteri yang tumbuh pada medium dan koloni bakteri tersebut mampu berpendar warna kehijauan dibawah sinar UV walaupun warna hijaunya dinilai begitu terlihat. Sehingga dari praktikum ini didapatkan mutan berupa bakteri Rhizobium yang mempunyai gen GFP+, amp+, + rif+





IV. KESIMPULAN
1. Mutasi dapat terjadi secara spontan dan buatan (induced)
2. Mutagenesis dapat diakibatkan oleh adanya mutagen berupa senyawa kimia, agensia biologi, dan perlakuan mekanik (sinar UV dan sinar X).
3. Transposon memicu adanya rekombinasi, mutagenesis, mobilisasi dan regulasi dalam gen.
4. Terbukti bahwa bakteri E.coli yang memiliki transposon mampu memindahkan gen Amp+ dan GFP kepada bakteri Rhizobium spp.